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信帆生物告訴大家:WB實(shí)驗(yàn)內(nèi)參的選擇

更新時(shí)間:2015-12-10      瀏覽次數(shù):1967

檢測一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確,或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對變化,方法是western blot。雖然,順利的時(shí)候Western Blot做起來很簡單,可不順的時(shí)候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦、假陽性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟,作為一種有活性的生物大分子,抗體和抗原的反應(yīng)畢竟不象1+1那么明確,而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達(dá)產(chǎn)物,確實(shí)是有一定的不確定性的。所以,嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中要求有良好的參照體系,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是非常有用的。

我們知道,要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中,目的蛋白表達(dá)量的相對多少,前提條件是等量的細(xì)胞上樣,才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時(shí),上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。艾美捷向您推薦使用內(nèi)參抗體來檢測您的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),或者校準(zhǔn)您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control),對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins),它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定,在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。在Western Blotting中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參,這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測內(nèi)參的表達(dá),由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定,借助檢測每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照,檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡單:如果樣品蛋白量有限,只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí),分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量,得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量,再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析,得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分,可以先檢測內(nèi)參,觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致,根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn),至內(nèi)參量一致為止;若內(nèi)參一致,即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。這樣雖然麻煩一點(diǎn),但是可以保證結(jié)果更有說服力,更可信。畢竟我們的實(shí)驗(yàn)是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鳌?/p>

常用的細(xì)胞總蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin,這其中zui近的國外文獻(xiàn)報(bào)道中使用GAPDH內(nèi)參的較多。對于一些植物的樣本,則需要特別的植物Actin蛋白作為內(nèi)參;同樣的,如果提取的樣本是細(xì)胞核蛋白,那么PCNA或者組蛋白H3都是被經(jīng)常使用的;而針對一些研究線粒體的客戶,那么Cox IV則被較多的文獻(xiàn)引用作為線粒體總蛋白的內(nèi)部參考。

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