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上海信帆報道:ELISA試劑盒雙抗夾心法的檢測原理

更新時間:2014-10-21      瀏覽次數:1441

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雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,操作步驟如下:

  1) 將特異性抗體與固相載體聯結,形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

  2) 加受檢標本,保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體復合物?! ∠礈斐テ渌唇Y合物質。

  3) 加酶標抗體,保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合  的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。

  4) 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色,測知標本中抗原的量?! ≡谘芯繖z驗中,此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,作一步檢測。

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  在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象,此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見1.3.2,圖1-4),如按常法測讀,所得結果將低于實際的含量,這種現象被稱為鉤狀效應(hook effect),因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時,反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

  假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性,這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

  雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當抗原成份,同時與固相抗體和酶標抗體結合,表現出假陽性反應。采用F(ab')或Fab片段作酶結合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項考核指標(參見6.2)。

  雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心。

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