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液體樣本甘油含量酶法測(cè)定試劑盒如何正確使用!

更新時(shí)間:2021-12-17      瀏覽次數(shù):899

液體樣本甘油含量酶法測(cè)定試劑盒如何正確使用!

描述:甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。脂蛋白酯酶能水解血液中的甘油三酯;胰脂酶可以水解食物中的甘油三酯;激素敏感脂肪分解酶能水解脂肪細(xì)胞中的甘油三酯。與游離脂肪酸一樣,甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo),但檢測(cè)更方便。本試劑盒采用甘油磷酸氧化酶法和經(jīng)典GPO-Trinder酶學(xué)反應(yīng)相結(jié)合的方法,通過比色法測(cè)定液體樣本中的甘油含量。經(jīng)過優(yōu)化后,操作步驟更加簡(jiǎn)單,檢測(cè)線性范圍在10-1200µmol/L,可靠性和重復(fù)性俱佳,適合生物醫(yī)學(xué)、食品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

原理:ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油,再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫;在過氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺,其光密度值與甘油濃度成正比。

適用范圍:測(cè)定血液、細(xì)胞培養(yǎng)基、體液、酒類飲料中的甘油濃度。

組成   

R1試劑 40 ml

R2試劑 10 ml     

4 mmol/L甘油標(biāo)準(zhǔn)品1 ml

4 oC,儲(chǔ)存3個(gè)月。

所需設(shè)備:酶標(biāo)儀、生化分析儀或721、722型可見光分光光度計(jì)。最佳工作波長(zhǎng)550nm,如無此波長(zhǎng)建議優(yōu)先選用570nm、次選530、490nm。

 操作步驟

 樣本處理:

酒類、飲品、清澈液體樣本:可直接進(jìn)行測(cè)定,如超過線性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后再測(cè)定。

培養(yǎng)液:取不含酚紅、無顏色、無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,如有細(xì)胞碎片應(yīng)4oC,,12,000g離心5min,取上清進(jìn)行測(cè)定。

血液:新鮮抗凝血,4oC,2,000g離心5min得到血漿;非抗凝血,先4oC靜置2h得到血清后,2000g離心10min,除去血細(xì)胞。將得到的血漿/血清70oC 加熱10分鐘滅活內(nèi)源脂肪酶,12,000g離心10min ,取上清測(cè)定或-20oC保存。

 工作溶液配制:4:1比例,取4 ml試劑R11 ml試劑R2混合,立即使用或4oC保存<1天,變色棄去。

 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋:用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體,將4 mM甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000500、250125、62.5、31.25、15.6257.8125 µmol/L,通常取其中4~6管即可,注意設(shè)置0濃度對(duì)照反應(yīng)管。

 甘油濃度測(cè)定:

參見下表進(jìn)行加樣。為使反應(yīng)時(shí)間盡量一致,減小實(shí)驗(yàn)誤差,可先加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品,然后再加入工作溶液。(注意:當(dāng)甘油濃度較低時(shí),可將待測(cè)樣品與工作溶液按照100µl:100µl體積混合,然后再進(jìn)行測(cè)定,但是如果樣品體積超過100µl時(shí)將會(huì)稀釋工作液中酶的濃度,使反應(yīng)靈敏度下降。如果待測(cè)樣品濃度超過線性范圍,可進(jìn)行適當(dāng)稀釋,然后根據(jù)稀釋倍數(shù)來計(jì)算樣品中甘油濃度。)

37oC25oC反應(yīng) 10分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零,然后測(cè)定各管OD值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度。

表一:

  酶標(biāo)微板測(cè)定的加樣比例(檢測(cè)范圍10-1200µmol/L

      (可對(duì)樣品和工作液比例進(jìn)行微量調(diào)整)


低濃度甘油樣品測(cè)定

高濃度甘油樣品測(cè)定


空白管

標(biāo)準(zhǔn)品

樣本管

空白管

標(biāo)準(zhǔn)品

樣本管

蒸餾水µl

50



5



標(biāo)準(zhǔn)品µl


50



5


樣品µl



50



5

工作液µl

150

150

150

195

195

195

 表二:

1 ml比色杯測(cè)定的加樣比例(檢測(cè)范圍10-1200µmol/L


低濃度甘油樣品測(cè)定

高濃度甘油樣品測(cè)定


空白管

標(biāo)準(zhǔn)品

樣本管

空白管

標(biāo)準(zhǔn)品

樣本管

蒸餾水µl

200



50



標(biāo)準(zhǔn)品µl


200



50


樣品µl



200



50

工作液µl

600

600

600

750

750

750

 本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)用,不做其它用途!

 


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