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線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)的說明介紹

更新時間:2019-05-07      瀏覽次數(shù):4670


    本試劑盒采用JC-1一種陽離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài),在低濃度時以單體的形式存在,高濃度時以多聚體形式存在,兩者的發(fā)射光譜不同,但均可在流式細(xì)胞儀綠色(FL-1)通道檢測出綠色熒光,JC-1可透過正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi),正常健康線粒體的膜電位(△y)具有極性,JC-1依賴于△y的極性被迅速攝入線粒體內(nèi),并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體,多聚體發(fā)射光為紅色熒光;可被流式細(xì)胞儀的紅色(FL-2)通道檢測到,而細(xì)胞發(fā)生凋亡時,線粒體跨膜電位被去極化,JC-1從線粒體內(nèi)釋放,紅光強度減弱,以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。本試劑盒可應(yīng)用于細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測。

操作步驟(僅供參考):

1、 配制JC-1染色工作液:

取適量JC-1 Stain (200×),按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀釋JC-1,劇烈Vortex充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×),混勻后即為JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1ml,其它培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推。

2、 設(shè)置陽性對照:

推薦CCCP(10mM)加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中處理細(xì)胞。隨后按照下述方法裝載JC-1,進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于特定的細(xì)胞,CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同,需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。

3、對于懸浮細(xì)胞:

a. 取1~6×105細(xì)胞,重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中,細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

b. 加入0.5ml JC-1染色工作液,顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。

c. 在孵育期間,按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸餾水的比例,配制適量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。

d. 37℃孵育結(jié)束后, 4℃ 600g離心3~4min,沉淀細(xì)胞。棄上清,注意盡量不要吸除細(xì)胞。

f. 再用JC-1 Buffer(1×)重懸后,用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察,也可以用熒光分光光度計檢測或流式細(xì)胞儀分析。

4、對于貼壁細(xì)胞:

注意:對于貼壁細(xì)胞,如果希望采用熒光分光光度計或流式細(xì)胞儀檢測,應(yīng)先收集細(xì)胞,重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

a.吸除6孔板培養(yǎng)液,根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次,加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

b. 加入1ml JC-1染色工作液,充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。

c. 在孵育期間,按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸餾水的比例,配制適量的JC-1 Buffer(1×),并放置于冰浴。

d. 37℃孵育結(jié)束后, 吸除上清,用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次。

e. 加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

f. 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對于純化的線粒體:

a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀釋5倍。

b. 0.9ml 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10~100μg純化的線粒體。

c. 用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測:混勻后直接用熒光分光光度計進(jìn)行時間掃描,激發(fā)波長為485nm,發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀,激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm時,可以在475~520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外,也可以參考下面步驟6中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。

d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察:方法同下面的步驟6。

6、熒光觀測和結(jié)果分析:

檢測JC-1單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm,發(fā)射光設(shè)置為530nm;檢測JC-1聚合物時,可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm,發(fā)射光設(shè)置為590nm。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常,細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

 

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)注意事項
1,JC-1(200×)在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi),可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2,請勿把JC-1染色緩沖液(5×)全部配制成JC-1染色緩沖液(1×),本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液(5×)。

3,如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀,必須全部溶解后才能使用,為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。 JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

4,應(yīng)避免反復(fù)凍融。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×),否則導(dǎo)致JC-1很難充分溶解,嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測??梢?0~25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用.

5,裝載完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗滌時,盡量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右,此時的洗滌效果較好。

6,CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑,有毒,請注意小心防護(hù)。

 7,為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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